灵长类特有基因的进化突变激动了灵长类大脑皮层的扩张。关联词，先前功能不解的保守基因是否也在灵长类动物大脑扩张中阐扬要道作用仍然是个未知数。在这里，咱们体恤溴氮(POU3F2)，一种编码神经转录因子的基因，持续在灵长类和小鼠中抒发。与对小鼠大脑发育的有限影响比较，溴氮食蟹猴的双等位基因敲除(束状猕猴)在妊娠中期前是致命的。组织学分析和单细胞转录组夸耀溴氮枯竭减少RGC的扩张，斥地早熟分化，改变端脑神经发生的轨迹。溴氮，四肢一个上游因子，箝制神经节隆起的规格和分化。另外，咱们敬佩了溴氮从食蟹猴到东谈主类RGC。溴氮可获胜调度SOX2和车站3惊奇霍普克斯.咱们的发现揭示了一个昔日未知的机制溴氮，一个保守的基因，通过赢得新的机械功能来驱动早期灵长类端脑的发育。
简介大脑发育中的一个挑战是怎么领路现有的哺乳动物，如山公和老鼠，使用相似数目的基因，但显豁领有更复杂的大脑结构和功能(1)尤其是皮层。灵长类动物皮质扩张的性情是端脑脑室区辐射状胶质细胞（RGCs）的增殖延长和加多，rgc随后扩展到脑室下区（SVZ）(2–5)在灵长类动物中，RGC比老鼠更丰富，并形成一个更为扩展的SVZ，即由“基础”RGC（bRGCs）驱动的外部SVZ(6)关联词，导致灵长类rgc扩张的分子机制仍不明晰。一种表面以为，这些适合是通过基因抒发的变化而进化的(7–9)识别赋予RGCs以灵长类特有的促增殖性情的遗传因素，对于表现灵长类动物皮质扩张的特定方面是不可或缺的。一种设施需要敬佩哪些基因、基因组调控序列或信号通路表现出灵长类动物特有的抒发模式，对RGCs具有特有的功能。
通过对哺乳动物基因组或基因抒发的比较分析，咱们发现了一些灵长类动物特有的分化特征，这些特征是灵长类动物大脑皮层扩张的要道。表型进化的一个驱动因素与基因抒发模式的变化辩论，举例骨分泌素(1);细胞外基质包括胶原卵白、层粘连卵白、卵白多糖和整合素(10);ASPM公司(11);血小板源性滋长因子D（PDGFD）–PDGFRβ（PDGFRβ）信号通路(12)第二个进化驱能源是灵长类特有的或新的基因的出现，比如特定的长非编码RNA(13)和microRNA(14),TMEM14B型(15),TBC1D3(16),诺奇2NL(17,18)，和ARHGAP11B型(19,20)这两类基因的功能赢得主若是由现有基因的进化突变引起的，包括DNA调控元件的赢得、氨基酸的置换和基因的复制。第三个可能的进化驱动因素长短原生物种和灵长类物种之间的保守基因，它们在灵长类动物中赢得了新的功能。敬佩第三类基因带来了挑战，因为这些保守基因的功能在啮齿类动物模子中持续无法评估。
在咱们对食蟹猴端脑发育的组织学变化的初步研究中，咱们不测地发现BRN2，一种保守的真是的神经前转录因子（TF）在胚胎36天（E36）的VZ早期RGC中犀利抒发（图S1），但标志着小鼠的晚期RGC和表层皮质神经元(21–23)这些驱散标明，BRN2在猴端脑发育经过中的抒发显豁早于小鼠。因此，咱们假定BRN2在山公的端脑发育经过中起要道作用，而在小鼠早期发育经过中其功能有限。为了考证这个假定，咱们制作了BRN2基因敲除山公。通过组织学分析和单细胞测序，咱们研究了以下问题：（1）BRN2在小鼠和猴皮质的时空分散互异；（2）BRN2在灵长类早期端脑发育中的作用是什么，BRN2调度灵长类动物端脑发育的可能机制是什么。
驱散BRN2标志着食蟹猴端脑发育早期的rgc为了筛选出灵长类动物中存在但能触发新功能的要道基因，咱们研究了食蟹猴的细胞发育轴和基因抒发模式(束状猕猴)胚胎大脑。为此，咱们源头通过免疫染色分析皮质发育经过中神经祖细胞特异性标志的抒发。东谈主神经上皮细胞（NEPCs）具有PAX6的高阳性率和SOX1的延迟抒发等特殊的分子特征(24)咱们不雅察到E29的猴神经细胞是由具有多个假分层层（图S1A）的NEPC组成的，雷同于小鼠E9。5个NEPC(24)终点是，咱们发现PAX6的盛大抒发，但莫得SOX1、EOMES（中间祖细胞（IP）标志物）和NEUROD2（神经元标志物），以及ZO-1（N-Cad介导的粘附一语气的NEPC标志物）的分歧称分散（图S1A）(14)违犯，在E36处抒发的SOX1、EOME和NEUROD2标明，NEPC还是调动为RGC（图S1B），很是于正在发育的E10中的RGC。5小鼠皮层(24)E49和E72的基因抒发模式（图S1、C和D）与E12的发育皮质保捏一致。5和E14。5个鼠标（图S1、F和G），由Smart总结等等。(25)还有江和纳尔德利(26).
接下来，咱们查验了皮质类固醇发生特异性的一般性TFs的抒发，包括EOME（一种IP标志）、NEUROD2、SATB2（皮质神经元标志物）、FOXP2（深层神经元标志物）、CUX1和BRN2（表层神经元标志物）（图S1，a到G）。SATB2的显豁产物+皮质神经元和EOMES+IPs由E36 SVZ皮质板（CPs）（图S1B）和FOXP2启动+e49cps的深层神经元。CUX1型+在E72CPS中检测到表层神经元（图S1D）。出乎意象的是，BRN2四肢一种表层神经元标志不仅在e72cps中犀利抒发，何况从E30运转在VZ和SVZ的rgc中也有犀利抒发(图1，A和B，以及图S1，B至D）。通过比较小鼠皮层神经发生(26)咱们得出论断，除了BRN2在E29到E72猴皮质的神经发生阶段和抒发模式与E9相似。5至E14。5小鼠皮质(图1A至C以及图S1，A至G）(25).
图1BRN2在食蟹猴皮层发育经过中的时空分散与RGC扩张的关系。
(A和B)PAX6和BRN2在猴低级视皮层冠状面扩张经过中的动态抒发。BRN2源头在胚胎第30天（E30）（A）在NEPCs中抒发，并在E49（B）沿VZ向SVZ迟缓蔓延。皮质层通过4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）和PAX6染色顽固。(C)对E9进行Brn2和Pax6的免疫组化分析。5（顶部）和E12。5（底部）小鼠新皮质。(D)夸耀BRN2在E40猴低级视皮层冠状区的抒发模式的图像。(E)在BRN2和brvz的双重染色中抒发brv2和brvx60+)或BRN2缺失（BRN2?)分区。BRN2中形成了显豁的SVZ+区域，但不在BRN2?区域。(F)BRN2和PAX6在BRN2中抒发的定量分析+和BRN2?分区。数据以平均值±扫描电镜清晰(n=3片）；>每组计数300个细胞。(G)p-波形卵白（PVI）和KI67在BRN2的E40 VZ和SVZ中的抒发+或BRN2?分区。定量数据仅来自细胞分裂发生的尖端区域的细胞。数据以平均值±SEM清晰，n=3片；>每组计数400个细胞。箭头清晰阳性细胞。（a到d）矩形区域的放大倍数更高。(H)左边是E40的皮质图，右边是测量猴胎脑全皮层和BRN2抒发细胞厚度的示意图。(我)与（H）关系的E40猴新皮质BRN2分散与皮质厚度的关系。（H）中的肇始位点和侧向位点对应于（I）中的肇始位点和侧向位点。蓝色，DAPI，核染色。比例尺，100μm。
BRN2在小鼠和猴皮质的时空分散互异BRN2在早期RGCs中的抒发（图S1B）揭示了BRN2可能在灵长类动物早期皮质发育的特有方面，促使咱们进一步研究BRN2在猴胚胎皮层中的时空分散，从早期（E29）到中期（E72）(25).由于BRN2和BRN1在小鼠体内具有高度的保守性和相互抵偿作用(22)，咱们使用了一种BRN2单克隆抗体，它能特异识别BRN1中不存在的BRN2的N端肽。免疫组织化学染色夸耀BRN2在E30运转在外侧NEPCs中抒发，到E40时，BRN2迟缓沿VZ（PAX6抒发细胞）向外侧、内侧和腹侧向背侧蔓延(图1，A和B和无花果。S1，A到D，以及S2，A到C）。E49的分散包括了通盘皮质的VZ/SVZ，E72分散在通盘皮质，包括皮质表层（图S2、B和C）。与PAX6比较+终点位于VZ/SVZ的电板，BRN2+细胞在发育过度后迟缓向皮质移动，并在E72到达CP(图1，A和B和无花果。S1，A到D，以及S2，A到C）。这些驱散标明BRN2+皮层神经元在E72产生。违犯，咱们莫得不雅察到Brn2在小鼠E9中的抒发。5皮层（图S1E）。咱们第一次在E12发现它。5神经节隆起（GE），但不在皮质VZ区(图1C以及图S2D）。BRN2在E14中通俗抒发。5端脑，包括VZ和CP（图S2D）。BRN2的抒发模式与先前的研究驱散一致(21–23)这些数据标明，BRN2在发育经过中的抒发在猴皮层比在小鼠皮层运转的更早。
为了进一步考证BRN2在灵长类和非灵长类物种中的抒发互异，咱们使用一种已报谈的分化系统[碱性成纤维细胞滋长因子（bFGF）斥地]将小鼠和猴胚胎干细胞（ESCs）斥地到神经外胚层，使ESCs梗概自觉地分化为一般的神经上皮干细胞（NESCs）（图S2E）(27)咱们发现，BRN2源头在分化后6天（pdD6）在SOX1和SOX1抒发之前（图S2、F和G），BRN2源头出当今枯竭SOX1抒发的小鼠pdD15 ESC繁衍细胞中（图S2、H和I）。因此，BRN2在体外神经分化经过中的抒发模式与体内一致。
接下来，咱们研究了BRN2抒发与RGC增殖和VZ扩张的关系。聘用BRN2在外侧内侧/背侧VZ分裂散分歧称的E40皮质(图1D)咱们不错评估RGC扩增与BRN2抒发的关系性。与未用BRN2清晰的区域比较（BRN2?咱们不雅察到BRN2抒发区（BRN2）的VZ/SVZ加多+区域）(图1E).BRN2中BRN2和PAX6的双重染色和定量?和BRN2+分区也扶助这一驱散(图1F)此外，通过P-波形卵白（PVI）和KI67免疫染色法对根尖名义RGC的增殖率进行定量分析，发现BRN2中增殖细胞的频率加多+区域(图1G)领导BRN2抒发与RGC增殖辩论。BRN2阳性细胞层厚度与皮质厚度高度关系(图1、H和I)这一驱散领导BRN2抒发的发生和经过与VZ和皮质的扩张精准一致。总之，BRN2在啮齿类动物和灵长类动物之间的时空分散互异建议了一个意念念的可能性：BRN2可能在灵长类RGC增殖、SVZ扩张和端脑发育中起要道作用。
溴氮-敲除猴胎在妊娠中期前是致命的溴氮突变不行斥地小鼠大脑皮层缺损，这是由于Brn1(22,28,29)。E14之前RGC的数目莫得权贵互异。5在大脑皮层中间神经元的产生和移动中Brn1/溴氮双突变体端脑(22)为了研究BRN2在灵长类动物大脑发育中的作用，咱们树立了一个双等位基因溴氮-使用CRISPR-Cas9系统的零食蟹猴模子(图2A) (30)咱们筛选出两对以猴外显子为靶点的单导rna（1型：sgRNA-A+B，1-kb缺失；2型：sgRNA-A+C，0.5kb缺失）溴氮基因(图2B)由于使用0.5和1-kb缺失可能比使用sgRNA更成心于功能性敲除，咱们分别将sgRNA-Cas9核酸酶复合物[核糖核卵白（RNP）]打针到1型或2型食蟹猴胚胎中。团聚酶链反应（PCR）和测序夸耀95%（19/20）的1型处理胚胎在溴氮其中70%（14/20）的胚胎夸耀1kb大片断缺失（图S3，a和B）。通盘2型处理的胚胎（12个，共12个）剪辑告捷，有66.67%（8/12）0.5-kb片断缺失（图S3、A和B）。因此，咱们将11个1型处理的胚胎和67个2型处理的胚胎分别移植到6个和23个代孕受体中。8个胚胎（1型和2型处理的胚胎分别为10.25%、1个和7个）告捷植入，但2个胚胎在4-5周流产(图2C)但在此期间，对照胚胎的着床和发育效果为26.92%（26个胚胎中的7个）。这些驱散标明溴氮突变会影响胚胎存活。
图2.生成溴氮-击倒(溴氮?/?)山公使用CRISPR-Cas9系统。
(A)生成和分析的使命流溴氮-KO山公。RNP，gRNA-Cas9核酸酶复合物。(B)靶基因剪辑示意图。不同神气的三角形夸耀sgRNAs办法的不同位置。两对sgRNA（A+B或A+C）原则上分别斥地Ⅰ型[约1091碱基对（bp）缺失]和Ⅱ型（近488bp缺失）基因突变。(C)本研究中通盘胎儿的详备信息。两个胎儿（080460和081012）在妊娠期间流产，咱们未能收罗他们的组织进行进一步分析。(D)野生型（WT；溴氮+/+)以及溴氮-击倒（KO，溴氮?/?)胎儿在E29、E36和E49。插入物是猴脑的放大镜，夸耀在溴氮?/?E36和E49胎儿。比例尺，3.7毫米。不，不查验。(E)用琼脂糖凝胶电泳法检测通盘敲除猴的PCR产物。溴氮+/+样本（123044-1）夸耀为靶基因剪辑的阴性对照。P、 胎盘；B、 脑细胞。(F)BRN2和SOX1的免疫染色溴氮+/+和溴氮?/?猴胎皮质，证实BRN2缺失溴氮?/?皮质。蓝色，DAPI，核染色。比例尺，100μm。IHC，免疫组织化学。
凭据猴脑发育轴和BRN2的时代抒发（图S1），咱们源头通过剖腹产收罗E29和E36胎儿进行基因分型、转录和组织学分析(图2，C至F)莫得溴氮-敲除猴胎发育到妊娠中期，很是于小鼠杰出E12期。咱们在E49处发现严重水肿，拒绝妊娠。咱们在E36和E49不雅察到显豁的脑血管发育很是溴氮?/?胎儿(图2D)空洞起来，这些驱散标明溴氮基因敲除在妊娠中期之前对猴胎是致命的。PCR和Sanger测序驱散标明，通盘基因剪辑的胎儿均告捷剪辑并捎带双等位基因突变(图2E和图S3C），这是进一步考证BRN2卵白免疫染色(图2F).
使用两个不同的指令RNA对不错退缩不雅察到的表型由非靶点突变引起的可能性。接下来，咱们通过基因组DNA团聚酶链反应和测序，进一步评估CRISPR-Cas9系统是否在基因修饰猴体内引起其他突变。分析了20个高电位非靶点（表S1）。DNA测序证实了溴氮通盘猴胎中莫得可检测到的靶外效应的位点（表S1）。凭据这些驱散，咱们得出论断溴氮基因在这些山公身上被告捷地敲除了。
溴氮缺失导致猴皮质发育很是鉴于BRN2在早期RGC中抒发，咱们专揽RGC标志评估RGCs的表型。咱们不雅察到正常的端脑发育溴氮?/?E36胎儿，标明溴氮缺失并不影响端脑的源头形成（图S4A）。免疫组化染色夸耀E36的胎儿有显豁的缺失溴氮?/?但在皮层中不存在，天然PAX6的抒发和RGC的增殖莫得显豁互异溴氮?/?和溴氮+/+（野生型）端脑（图S4A）。SOX2耗损溴氮?/?GEs与BRN2在早期端脑GE区的源头抒发一致（图S2、B和C）。SOX2抒发总计丧失溴氮?/?E49全端脑RGC(图3A)，夸耀了溴氮RGC的缺失在过度发展中变得显豁。SOX2需要和洽溴氮四肢合营因素在神经范例和NP惊奇中的作用(31)意味着溴氮灵长类RGC的功能可能终点有助于保管SOX2.在早期东谈主类大脑发育期间（妊娠第10周之前），大大皆RGC区是垂直标的的(32,33)因此，有丝分裂纺锤体取向的改变改变了RGC细胞数目和神经元数目(34).与溴氮+/+皮质，RGCs溴氮?/?通过KI67和PVI染色，皮质VZ减少了RGC的垂直分裂，而斜角分裂则协同加多(图3，B和B′) (34)驱散标明溴氮缺失通过改变有丝分裂纺锤体的标的来减少RGCs的增殖。此外，在VZ/SVZ RGC中激活神经元标志物TUJ1和NEURRD2，并加多SATB2的产生+神经元(图3C图S4B）夸耀RGCs的神经元早熟分化溴氮?/?皮质。这些数据，加上IP标志物EOMES莫得变化（图S4B），标明这种早熟神经元的产生是由于rgc的获胜神经发生，而不是通过IP。因为BRN2的抒发与皮层的形成和扩张辩论(图1、H和I)咱们检测了HOPX的抒发，HOPX是反应灵长类oSVZ扩张经过中bRGC丰采丰采的紧迫转录因子(14,35,36)HOPX在灵长类动物中的抒发发生在胚胎VZ/SVZ的早期，但在皮质激素形成的中期主要在oSVZ的bRGCs中抒发（图S4C）。溴氮劣势导致VZ/SVZ的HOPX耗损(图3，D和D′)这个驱散意味着溴氮可能通过激活来促进RGC移动霍普克斯总的来说，这些发现揭示了溴氮是灵长类动物与小鼠不同的RGC保管的要道。在老鼠身上，把两者皆击倒Brn1和溴氮在E12扼制神经发生和从VZ移动。5、早期过度抒发溴氮原位促进RGC朝表层神经元的很是气运周折(21).
图3.溴氮缺失导致猴皮层发育很是。
(A到D)汲取原发性体感皮质消失区域的冠状切片对E49进行比较分析溴氮+/+和溴氮?/?端脑（见材料和设施）。（A） 中的SOX2和PAX6抒发式溴氮?/?和溴氮+/+分别是皮质。（B和B′）代表性染色图像（B）和定量（B′）的PVI，KI67和DAPI溴氮?/?和溴氮+/+皮质细胞。DAPI染色顽固细胞分裂标的。RGCs的分裂标的的量化数据以means±SEM清晰(n=6张代表性图像；>每组计数100个细胞*P<0.01）。（C） TUJ1和SOX1的典型染色图像溴氮?/?和溴氮+/+分别是皮质细胞。（D和D′）HOPX和SOX1抒发式溴氮?/?和溴氮+/+分别是皮质。右图像是左图像的较高放大倍数。（D′）HOPX细胞从VZ区移动到SVZ区的定量（means±SEM，n=4张代表性图像；>每组计数500个细胞*P<0.01）。比例尺，100μm(E和F)主要神经细胞的可视化溴氮+/+和溴氮?/?通过长入流形贴近和投影（UMAP）分析，跨三个不同阶段的单细胞。(G)代表RGC的经典标志图(SOX2)，中间祖细胞（IP）(伊奥姆斯)和繁盛性神经元（ExN）(STMN2型)分别是。(H)每种细胞类型在皮质发育中的比例动态。(我)皮质细胞在三个不同阶段的发育轨迹。RG-IP-N（RGC-IP-to-neuron）是波折阶梯，而RG-N（RGC-IP-to-neuron）是获胜阶梯。虚线夸耀RGCs的发展轨迹。箭头清晰这些轨迹的标的。(J)在溴氮?/?和溴氮+/+皮质（见表S3）。代表性转录因子（TFs）、基因本色论（GO）术语和京皆基因与基因组百科全书（KEGG）旅途。蓝色，DAPI，核染色。
进一步刻画溴氮在皮质细胞类型组成和转录谱上，咱们为溴氮+/+和溴氮?/?在E29、E36和E49期使用液滴形成微流控安装（10X基因组学平台）的端脑(图2A以及图S2A）。经过质地箝制和过滤后，咱们赢得了93018个最终细胞用于后续分析（图S4D）。计划到山公资源有限溴氮?/?胎儿，咱们源头分析了两个E29大脑，不雅察到两个样本之间的细胞类型组成相似（图S4、E和F以及表S2）。这些驱散标明，高通量期间可用于构建端脑舆图集。接下来，咱们整合溴氮?/?和溴氮+/+三个不同阶段样本（E29、E36和E49）的细胞蚁合在沿路，并基于典型细胞类型特异性标志的抒发水平对通盘细胞类型进行扫视（图S4、G至I和表S2）。
哺乳动物的新皮质包含两个主要的神经元亚群：繁盛性神经元和扼制性中间神经元。ExNs占神经元总和的80%，发源于皮层VZ/SVZ的rgc或IPs。因此，咱们源头聘用并整合通盘RGC、IP和ExN单细胞样本溴氮+/+和溴氮?/?细胞升迁三个阶段来跟踪它们的发育轨迹(图3，E和F)在经典标志和互异抒发基因（DEGs）的基础上，咱们将这些细胞群分为RGC（八簇）、IP（一簇）和ExN（四簇）(图3，E至G;图S5，A和B；以及表S3）。比较之下，咱们莫得不雅察到在细胞类型和比例上的显豁互异溴氮+/+和溴氮?/?皮质分别位于E29或E36(图3H)。可是，与溴氮+/+猴，E49的RGC比例权贵着落，IPs和ExNs显豁加多溴氮?/?皮质(图3H与咱们的组织学分析相一致。
通过分析细胞轨迹和假时代，咱们发现溴氮枯竭改变了RGC发育和神经发生的轨迹和标的(图3I以及图S5C）。在溴氮+/+皮质、RGC的发育从肇始点运转顺从两条轨迹（R1或R2标的），与发育阶段无关(图3I以及图S5C）。关联词，E36和E49的发展轨迹溴氮?/?由于集群4中一个种群的丢失，皮层被松弛(图3I以及图S5C）。在溴氮+/+皮层、神经发生在E29时顺从获胜阶梯[RGC-to-neuron（RG-IP-N）]和波折阶梯[RGC-IP-N-neuron（RG-IP-N）]，但波折阶梯主要在E36和E49(图3I).正如所料，因为溴氮源头抒发于E29之后，溴氮?/?和溴氮+/+E29的皮质细胞在RGC的发育和神经发生方面有着相似的轨迹(图3I)关联词，获胜通路主要参与了神经发生溴氮?/?皮层细胞在E36和E49专揽着通盘经过(图3I)此外，假时代驱散证实了分化要领的早期启动溴氮-RGC不及（图S5C）。这些驱散和组织学分析沿路(图3，A至C，图S4B）夸耀了RGC的早熟和原位神经元分化。从E49到e39，溴氮缺失迟缓导致猴皮层发育很是，相宜溴氮皮层的时代抒发模式。这些驱散进一步阐述注解BRN2缺失驱动了这些RGC表型。
办法：探讨其分子机制和卑劣基因（包括TFs）的性情溴氮，咱们分析了溴氮+/+和溴氮?/?皮质(图3J以及表S3）。下调的转录因子与神经祖细胞辩论，包括赫斯1,霍普克斯，和SOX2而上调的转录因子主要与神经源性因子辩论溴氮?/?细胞，如TBR1和卫星2与咱们的免疫组化不雅察驱散一致(图3J以及图S5，D至H）。终点地，赫斯1，Notch通路的一个紧迫效应因子，促进皮层祖细胞自我更新(17,37)，夸耀出E49的权贵减少溴氮?/?皮质，尤其是在第4簇（图S5E）。这个驱散与溴氮在老鼠身上，这对赫斯1(21).与染色驱散一致(图3，A和D，以及图S4A），霍普克斯和SOX2在E36中抒发模式显豁着落溴氮?/?在E49时，大脑皮层和溴氮?/?皮质（图S5、D和F）。咱们的研究驱散标明溴氮通过多种机制调度RGC的保管和SVZ的形成。
神经元间质发育很是溴氮?/?山公皮层扼制中间神经元在皮层的发育和功能中起着至关紧迫的作用。灵长类中间神经元主要开始于三个不同的分子和阵势学区域：内侧、外侧和尾端（分别是MGE、LGE和CGE）(38)咱们不雅察到BRN2在通盘发育经过中的抒发(图4A图S6A），这让咱们假定溴氮可能在神经元间的发育中起作用。咱们使用了COUP-TFII（NR2F2，CGE或LGE的标志）和NKX2-1（MGE的标志）(38)]免疫染色辩认LGE/CGE和MGE(图4B以及图S6D）。与中的LGE和MGE的明白规模比较溴氮+/+端脑、苏木精和伊红染色夸耀溴氮?/?在E49，LGE和MGE很难分裂，因为它们之间莫得显豁的规模（图S6，B和C）。与溴氮+/+CGE或LGE、COUP-TFII和NKX2。1个被通俗激活溴氮?/?GEs，包括MGE(图4B以及图S6D）。驱散标明，MGE与CGE/LGE的分离受到影响溴氮?/?通用电气公司。为了揭示潜在的表型和分子特征，咱们分析了单细胞RNA测序（scRNA-seq）转录组溴氮+/+和溴氮?/?中间神经元。咱们凭据DEGs和经典标志将这些中间神经元分为10个簇，其中杰出了中间神经元祖细胞（iNPs；第3、5和8个簇）和分化中间神经元（其他7个簇）(图4C;图S6、E和F；和表S4）。正如预期的那样，INP在溴氮?/?与之比较溴氮+/+GEs跟着分化中间神经元的显豁加多而权贵镌汰（图S6G）。细胞轨迹和假时期析标明溴氮突变改变了神经元间的分化轨迹和训诲阶梯(图4D以及图S6H）。
图4.溴氮猴里面发育很是。
(A)BRN2和COUP-TFII染色夸耀BRN2通俗分散于端脑神经节隆起（GEs）。PSB，球底缘。(B)NKX2-1和COUP-TFII在溴氮+/+和溴氮?/?GEs，夸耀COUP-TFII在溴氮+/+而CGE/LGE在举座上显豁被激活溴氮?/?GEs（包括LGE/CGE和MGE）。部分溴氮+/+和溴氮?/?来自于等效的冠状面（细节见材料和设施）。(C)用UMAP分析夸耀中间神经元和中间神经元祖细胞（iNP）的主要类别。(D)中间神经元和iNPs的发育轨迹标明BRN2的丢失改变了中间神经元的发育轨迹。第3簇细胞显豁减少溴氮?/?山公。(E)之间溴氮+/+和溴氮?/?中间神经元和iNPs（表S4）。有代表性的转录因子（TFs）、GO术语和KEGG阶梯。(F和G)BRN2段+/+和BRN2?/?端脑来自换取的冠状面。（F和G）HOPX和SOX1的代表性染色图像溴氮+/+（F） 以及溴氮?/?（G） 通用电气公司。F1和G1是（F）和（G）中方块的放大倍数。(H)PAX6和SOX2在溴氮+/+和溴氮?/?通用电气公司。(我)SST和NKX2-1在溴氮+/+和溴氮?/?分别是GEs。(J)钙视网膜卵白（CR）在溴氮+/+和溴氮?/?端脑。箭头指令CR中间神经元的移动标的。通盘免疫荧光图像均来自端脑头端尾侧的冠状切片。刻度条，500μm。蓝色，DAPI，核染色。
通过比较分析，咱们顽固了DEGs和转录因子，包括霍普克斯,SOX2，和赫斯1，它们在溴氮?/?通用电气公司(图4E和表S4）。在溴氮?/?中间神经元与细胞分裂和增殖一致，而激活的基因则在轴突指令和神经发生中富集(图4E)为了进一步了解表型，咱们不雅察了簇的变化，不雅察到一个细胞群[cluster 3（C3）]在溴氮?/?中间神经元(图4C以及图S6G）。终点是一些基因，比如霍普克斯和赫斯1，在C3群体中特异抒发溴氮+/+E49的单位格(图4E以及图S6I），这意味着溴氮不错调度这些基因。免疫组化夸耀HOPX抒发于细胞间的移动流中溴氮+/+MGE公司(图4F)，鉴于溴氮null导致区域中的HOPX丢失(图4G)这些数据标明C3是由这些HOPX产生的+移动流中的细胞。与皮层相似，GEs中SOX2的抒发也受到显豁的扼制溴氮劣势(图4H以及图S6I）。这些驱散标明BRN2是保管iNP所必需的，而BRN2的枯竭促进了中间神经元的早熟产生。
鉴于大大皆灵长类新皮质γ-氨基丁酸能（GABAergic）中间神经元发源于MGE或LGE/CGE(38)咱们查验了欧洲的两个区域。在MGE中，有两条主要阶梯箝制着中间神经元的发育(39).NR2F1MGE标志物在溴氮?/?细胞（图S7A），这促使进一步评估这两种阶梯的变化。第一条旅途是NKX2-1/LHX6-SOX6/SATB1转录级联对MGE中间神经元的产生至关紧迫(40)如预期，这些基因抒发模式在溴氮?/?细胞（图S7B），这意味着通路激活。另一个阶梯是同源域TFs的DLX家眷，它被以为是中间神经元发育的基因调控蚁合的中枢(40)咱们不雅察到溴氮枯竭显豁激活DLX基因蚁合，促进包括滋长抑素（SST）在内的神经元间分化(图4I以及图S7C）。
接下来，咱们研究了LGE/CGE中中间神经元的发生。在灵长类动物中，大部分CR（calretinin）神经元发源于LGE和CGE，而LGE和CGE繁衍的中间神经元则优先占据皮层浅层(38)在LGE中，BRN2和NR2F2（COUP-TFII）呈排他抒发(图4A)COUP-TFII的抒发显豁加多溴氮?/?领导BRN2可能通过保管RGCs来限定NR2F2的抒发。溴氮劣势激活的CGE标志，包括NR2F2(41),NFIB公司，和阿皮斯2(42) (图4B以及图S7D），随后促进分化，向皮质浅层移动，以及CR中间神经元的新皮质分散(图4J以及图S7E）。此外，中间神经元发育很是是由溴氮这种劣势在端脑发育经过中越来越显豁。因此，溴氮四肢一个上游因素箝制着通盘灵长类动物GEs里面神经元的发生。
溴氮夸耀了东谈主类RGCs的保守功能造访溴氮咱们分析了东谈主类神经斥地经过中BRN2的时代抒发。如预期，BRN2在东谈主类早期NESCs中抒发，其抒发模式与灵长类动物高度一致（图S8A）。然后咱们生成了一个溴氮?/?通过基因剪辑从两个不同的克隆中赢得东谈主胚胎干细胞(图5A)然后按照要领将这些细胞分化成NESCs(43)产生皮质类器官(图5B).溴氮劣势不行影响东谈主NESCs的生成和典型的两层神经外胚层结构的形成(43) (图5B以及图S8，B到D），这意味着溴氮不需要东谈主类神经外胚层的产生，这与BRN2在猴体内的功能一致。经过20天的培养和斥地，溴氮+/+NESCs进一步自组织成皮质类器官，94%的细胞呈VZ样结构，抒发典型NP特异性标志，形成相宜N-CADHERIN和ZO-1极化分散的NESC极性(图5、B和C，以及图S8，B至D）(43).比较之下，简直通盘的类有机物溴氮?/?NESCs失去了NESC的极性和性情，随后无法产生皮质类器官(图5、B、C和G，以及图S8D）。
图5.溴氮猴RGCs的功能对于东谈主类RGCs是保守的。
(A)发电示意图溴氮-击倒(溴氮?/?)CRISPR-Cas9基因剪辑的东谈主胚胎干细胞（ESCs）。(B)专揽东谈主类野生型产生皮质类器官(溴氮+/+)以及溴氮?/?电子领悟箝制系统夸耀溴氮?/?ESCs失去了产生皮质类器官的才气。上头板夸耀皮质类器官生成图。(C)神经上皮标志物在皮质类器官中的抒发溴氮+/+和溴氮?/?电子领悟箝制系统。(D)增殖标志物KI67和PVI在乳腺癌中的比较溴氮+/+或溴氮?/?皮质类器官。DAPI染色顽固细胞分裂标的。(E)细胞分裂标的的定量研究溴氮+/+和溴氮?/?皮质类器质细胞（平均值±SEM，n=4个沉寂实验；>每组分别计数200个细胞）。(F)CUX1（一种表层神经元标志物）和FOXP2（一种深层神经元标志物）抒发的比较溴氮+/+和溴氮?/?皮质类器官。(G)FoxCux1-，和FoxPax2-细胞中阳性细胞的定量溴氮+/+和溴氮?/?皮质类器官。数据以平均值±SEM清晰，n=3片；>每组计数300个细胞*P<0.05。比例尺，100μm。
咱们还不雅察到溴氮通过KI67和PVI染色发现，丢失导致RGC增殖减少，垂直分裂减少，斜角分裂加多(图5，D和E) (34)分化试验标明溴氮缺失促进了深层神经元的早期生成(图5，F和G，以及图S8D）。因此，溴氮是东谈主体RGC惊奇所必需的。
机制溴氮调度灵长类动物端脑发育因为Brn1不错弥补溴氮当溴氮已删除(22,28,29)，咱们分析BRN1未不雅察到抒发上调BRN1在里面溴氮?/?东谈主胚胎干细胞繁衍的皮质类器官或猴胚胎皮质细胞(图6，A和B)这些驱散标明溴氮删除操作无法窜改BRN1在灵长类和东谈主类中的抒发。这些驱散标明，SOX2的权贵镌汰是在E36中初度发现的溴氮?/?猴皮质（图S4A）。因此，咱们推测溴氮不错通过获胜激活来调度RGC的扩张SOX2.使用全基因组染色质免疫千里淀测序（ChIP-seq）对发育中的东谈主皮质和东谈主胚胎干细胞开始的NESCs进行测序(43,44)，咱们敬佩了BRN2的获胜办法（图S9A）。咱们发现溴氮在启动子区SOX2(图6C，图S9B和表S5），一个保管RGC性情的要道基因。这个驱散标明溴氮可通过获胜监管SOX2抒发式。此外，HOPX是bRGCs的要道标志(14,35,36)，总计迷失在溴氮-击倒山公端脑。可是，咱们莫得检测到溴氮在霍普克斯（表S5），意味着溴氮可调度霍普克斯波折抒发。咱们驻扎到溴氮不错联接到车站3(图6D以及图S9C）。车站3对保管东谈主脑bRGC至关紧迫(35,45)可能是一个上游因素调度霍普克斯(35,45,46)此外，单细胞数据夸耀车站3抒发显豁受到扼制溴氮?/?皮质(图6E).总之，溴氮可能是灵长类神经发育早期的一个要道因素，可能通过多种潜在机制阐扬作用(图6F).
图6.监管机制溴氮灵长类端脑发育研究。
(A和B)比较BRN1抒发式介于溴氮+/+和溴氮?/?东谈主胚胎干细胞繁衍的皮质类器官（A）过火之间溴氮+/+和溴氮?/?猴皮质细胞（B）。数据以平均值±扫描电镜清晰(n=3）。NS，没什么意念念，P>0.05。(C)基因图夸耀BRN2、团聚酶II（Pol II）和对照（IgG）的密度SOX2东谈主类大脑皮层的启动子，标明溴氮联接到SOX2. (D)基因图夸耀BRN2、Pol II和对照（IgG）的密度车站3东谈主类大脑皮层的启动子，标明溴氮调度车站3通过获胜联接到车站3. (E)比较车站3中的抒发式溴氮+/+和溴氮?/?大脑皮层在溴氮?/?皮质**P<0.01。(F)总结溴氮猴端脑发育的调控机制。aRGC，尖端RGC。线的厚度和细度分别代表强行为和弱行为。箭头清晰激活，三叉戟线清晰压制。
参谋专揽猴敲除模子和东谈主类器官分析，研究了大鼠卵巢癌的时空抒发和功能溴氮在端脑发育经过中，灵长类动物和小鼠之间表现出显豁的互异。BRN2在早期胎猴新皮层和GEs中由VZ/SVZ的RGCs抒发，早于小鼠的RGCs(图1，A至C和无花果。S1，A到G，S2，A到D）(21).变异溴氮对妊娠中期前的猴胎是致命的，通过镌汰RGC的增殖导致新皮质和GEs的很是发育，并促进ExNs和interneurons的早熟发生。违犯，溴氮基因敲除小鼠在出身前不会导致胎儿逝世或大脑皮层神经元丢失(22,29)此外，咱们还揭示了溴氮调度灵长类动物大脑皮层的发育(图6)总的来说，咱们阐述注解BRN2是一种保守的转录因子，与小鼠比较，在山公身上赢得了新的和更紧迫的功能。咱们的研究发现溴氮对于发育中的灵长类端脑来说，这可能揭示了灵长类早期端脑发育的未知机制。
尽管溴氮对灵长类和小鼠的神经发育皆有孝顺，其功能在物种间有显豁互异。在老鼠身上，溴氮这种劣势只在有限的脑区出现很是，主若是不才丘脑视上核和室旁核(22,29)，同期溴氮灵长类动物的劣势导致大脑皮层和GEs的很是。在溴氮-敲除小鼠下丘脑视上核和室旁核的细胞也不行分化为训诲的神经元，导致出身后10天内逝世(47).违犯，变异了溴氮在妊娠中期前对猴胎儿形成致命性影响，通过镌汰RGC的增殖导致大脑皮层和GEs的早期很是发育，促进ExNs和interneurons的早熟发生。
表现灵长类动物大脑皮层的细胞和分子结构对于领路咱们的默契才气和疾病易理性至关紧迫。尽管取得了一些告捷，但咱们才刚刚运转表现界说灵长类大脑的进化经过中发生的基因变化(7).新皮质扩张的进化变化可能在不同的脉络上使用了多个经过(48)包括基因调控元件的变化和基因组的变化，从点突变到通盘基因叠加。这些变化包括基因抒发的改变，产生具有新功能的基因(9)导致灵长类特有基因的出现(1,15,17–20)进化功能的关系变化可能是由于赢得基因突变而引起的，这些突变在消失细胞中斥地了改变或新的功能(9)在研究中，咱们驻扎到溴氮灵长类动物的大脑发育与这些报谈的机制不同。BRN2卵白在不同物种间高度保守（图S9D），这意味着BRN2在小鼠和猴皮质之间的时空分散互异并不是由于BRN2卵白序列的进化引起的。咱们的研究驱散扶助了这么一个不雅点：在灵长类动物进化经过中，基因的不同期空分散在驱动端脑扩张中起着紧迫作用。咱们假定这么的分散使得先前未知的基因功能出现。因此，咱们的发现揭示了灵长类动物端脑发育的一种先前未被证明的进化机制。此外，小鼠和灵长类动物之间BRN2抒发模式和功能的互异意味着灵长类动物的大脑发育在小鼠中的重现性较差。咱们的发现强调使用物种特异性的基因模子来领路灵长类动物的大脑发育。
皮质神经元通过获胜或波折的神经发出产生，分别来自RGCs或RGCs-IPs。在灵长类皮质，波折神经发生（RGCs-IPs神经元）孝顺了大部分心经元。咱们发现了溴氮缺失斥地VZ-RGCs原位分化，并将波折神经发生调动为获胜神经发生（RGCs神经元）。咱们推测有几种可能的机制调度这些表型(图6F)源头，SOX和POU因子之间的相互作用在通盘青年动物中皆是保守的，在胚胎发育中起着要道作用。在这项研究中，咱们驻扎到SOX2，而不是SOX1，在溴氮?/?山公RGC，和溴氮获胜绑定SOX2发起东谈主(图6C以及图S9B）。这些发现，再加上E30后RGC中BRN2的抒发，清晰溴氮部分通过保留SOX2决定山公RGC气运的抒发式。第二，HOPX，灵长类bRGCs的要道标志(35,36,49)在E49中不存在溴氮?/?皮质。咱们的造访驱散夸耀溴氮劣势斥地的HOPX丢失随后扼制了RGC从VZ的分离。霍普克斯+灵长类动物新皮层中的rgc比发育中的小鼠新皮层中的低丰采显豁丰富(36,50)此外，咱们的芯片序列数据夸耀，来自觉育中的东谈主类大脑皮层和东谈主类神经干细胞溴氮绑定车站3.车站3据报谈，是RGC扩张的一个要道决定因素，伴跟着东谈主脑中RGC数目的加多(35)关联词，这些发现需要非常的详备的机械方面的视力。
间神经元发育很是溴氮?/?山公。咱们对皮层中间神经元发育的意志主要来自于老鼠的研究。小鼠和灵长类动物中间神经元的发育相称相似，但在阵势、基因抒发和特定中间神经元亚群比例方面存在紧迫互异(32,33)皮层中间神经元主要开始于MGE、LGE和CGE。尽管在灵长类动物中存在着皮层中间神经元和标志MGE和LGE/CGE区域的卑劣因子的一些发育和功能种种化(32,38)，箝制MGE和LGE/CGE规格和分离的上游调度器仍然未知。咱们的发现标明溴氮劣势权贵上调包括MGE在内的通盘GEs中COUP-TFII的抒发，这使得LGE和MGE无法分裂。这个驱散标明溴氮是MGE和LGE/CGE范例所必需的，而对小鼠的GEs莫得影响。据咱们所知，咱们当今披露溴氮四肢一个上游因子，箝制灵长类动物的MGE和LGE/CGE规格。因此，咱们提供一个例子来强调获胜研究灵长类大脑对进一步表现灵长类皮层中间神经元发育的紧迫性。
这里提供的数据提供了对溴氮-斥地端脑皮质发育。这些研究为揭示灵长类RGC增殖和中间神经元发育的机制奠定了基础。关联词，调控时空分散或卑劣信号传导的调控元件溴氮咱们还需要进一步的研究，凄婉的是咱们莫得发现溴氮妊娠中期致身后猴神经发育的功能。今后的使命应该发展归纳溴氮有条款地淘汰山公来管制这些问题。
材料和设施动物伦理声明雌性食蟹猴(M、 束状体)研究对象为5～8岁，体重4～6kg。通盘动物均被安置在云南省灵长类生物医学研究要点实验室（LPBR），在好意思式圭表笼中按12小时/12小时的光/暗周期进行单独饲养。通盘动物要领均预先赢得云南省要点保护区动物保护和使用委员会的批准，并按照外洋实验动物顾问协会灵长类动物伦理诊疗评估与招供协会的王法履行。
剖腹产与胎儿采集如前所述，剖腹产收罗了食蟹猴六个产前发育阶段（妊娠期29、30、36、49、55和72天）的胎儿(51).
组织加工与免疫组织化学收罗胎儿后，固定脑组织；轮番用10、20和30%（w/v）蔗糖溶液渗入；镶嵌OCT（最好切削温度化合物；樱花，4583）；在徕卡低温恒温器上以10～15μm的厚度切片。对于E29、E30和E36的样本，从胚胎猴身上分离出前脑突起，并以10μm厚的切片横跨大脑的头端尾侧。对于E40、E49、E55和E72的样本，分离出右侧胚胎半球，并在15μm厚的规模内对大脑的吻尾侧进行切片（图S2A）。对于免疫组化，切片组织在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤两次，用0.2%Triton X-100（Gibco，85112）过夜，在PBS中洗涤三次，在室温下用3%牛血皎白卵白（BSA；Solarbio，A8020）阻断1小时。载玻片与一级抗体孵育过夜，在PBS中洗涤，并在室温下在含有Alexa Fluor 488–、594–或647–联接二级抗体（1:600；Invitrogen）的紧闭缓冲液中培养2小时。在1:200至1:2000使用了以下一级抗体：SOX1，山羊（AF3369，研发系统）；DCX，小鼠（MABN707，密理孔）；TBR1，兔（AB10554，微孔）；TUJ1，小鼠（MAB1637，milipore）；NESTIN，小鼠（MAB5326，milipore）；TBR2，兔（ab23345，Abcam）；N-钙粘卵白，兔（GTX127345，GeneTex）；PAX6，兔（901301，生物传闻科文斯）；IBAL1，兔子（019-19741，Wako）；COUP-TFII，鼠标（PP-H7147-00，研发系统）；霍普克斯，兔（HPA030180，Sigma-Aldrich）；NeuroD2，兔（ab104430，Abcam）；GFAP，兔（z03429-2，达科）；SST，小鼠（sc-55565，圣克鲁斯生物期间公司）；GAD65，小鼠（ab26113，Abcam）；BRN2，兔（12137S，细胞信号期间）；NKX2。1、兔（AB76013，Abcam）；波形卵白，兔（14-9897，eBioscience）；ZO-1，小鼠（01-107，Invitrogen）；PVI，小鼠（D076-3S，MBL外洋）；CUX1，兔（SC13042，圣克鲁斯生物期间公司）；FOXP2，兔（ab16046，Abcam）；SATB2，小鼠（ab51502，Abcam）；米利替宁，小鼠；SOX2，兔（AB5603，milipore）；和KI-67，兔子（PA5-19462，Invitrogen）。
免疫组化汲取全脑10～15μm冠状切片。确保BRN2段+/+和BRN2?/?从等效的日冕水平，咱们使用以下设施。源头，将通盘大脑的各个部分按位置规则进行编号，然后按位置均匀地分为前、中、尾三个部分。第二，在每个部分的正中聘用两个玻片同期染色。中间部分的染色如所示图4B以及图S6（B和C），而尾端部分染色如图S6D所示。
gRNA的制备针对BRN2外显子的sgrna是由网站上的chop-chop在线软件计议的https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design聘用得分最高的前五名（表S1），并使用GeneArt Precision gRNA合成试剂盒（Invitrogen，A29377）在体外扩增和转录sgRNA寡核苷酸。这五种sgRNAs在成纤维细胞上的转染效果初度得到考证，并聘用其中三种效果较高的sgRNAs进行胚胎剪辑。
卵母细胞采集与体外受精卵母细胞收罗和受精如前所述(52)总之，聘用10只5～8岁月事周期正常的雌性食蟹猴四肢卵母细胞供体进行超数排卵，肌肉打针rhFSH（重组东谈主卵泡素α，GONAL-F，Merck serino）8天，rhCG（重组东谈主绒毛膜促性腺激素α，OVIDREL，Merck serino）于第9天进行。给药后32～35h，汲取腹腔镜卵泡抽吸法采集卵母细胞。将滤泡内容物置于37℃下含有0.3%牛血皎白卵白的Hepes缓冲酪氨酸白卵白-乳酸-丙酮酸（TALP）培养基（Caisson Labs，IVL01）。在旋即表露于TALP Hepes中的透明质酸酶（0.5 mg/ml）后（<1分钟）通过移液管从卵丘细胞中剥离卵母细胞，以允许肉眼聘用核训诲中期II（MII；第一极体存在）卵母细胞。
RNP打针、体外受精、胚胎培养和移植训诲卵母细胞立即进行胞浆内单精子打针（ICSI），然后在含有10%胎牛血清（FBS；Invitrogen，16140071）的CMRL-1066中培养，培养温度37°C，浓度5%CO2受闪耀过第二极体和两个原核的存在得到证实。出产溴氮-敲除胚胎，在ICSI前，咱们将一双sgRNA（2500ng/μl，1250ng/μl）和Cas9核酸酶（5000ng/μl；Invitrogen，A36499）夹杂注入每个卵母细胞，ICSI前注入总体积为5pl。在圭表条款下，用微量打针系统在卵母细胞胞浆中进行微量打针。然后将受精卵（野生型和BRN2-RNP处理）培养在含有10
